Metode dijagnostike
1.Chlamydia trachomatis
Za dijagnostiku Chlamydia trachomatis koristimo dvije metode;
prva je DIREKTNA IMUNOFLUORESCENCIJA S MONOKLONSKIM PROTUTIJELIMA – „ FLUOROTECT CHLAMYDIA “
1. NAČELA TESTA
Fluorotect Chlamydia je brza, in vitro metoda koja dopušta direktno bojanje kliničkog uzorka. Svi Chlamydia trachomatis serotipovi dijele zajednički antigen, tj. protein koji je smješten u vanjskoj membrani staničnog zida. Za detekciju tog antigena koriste se monoklonska protutijela obilježena fluorescentnom bojom (FITC). Obilježena protutijela FITC- om vežu se specifično za Chlamydia trachomatis ako je prisutna u metanol fiksiranom medicinskom uzorku prethodno nanešenom na jažicu predmetnog mikroskopskog stakla. Ispiranje puferom odstranjujemo FITC-om obilježena protutijela koja nisu vezana.
2. UZIMANJE UZORKA
a) cervikalni uzorak: trebaju sadržavati mnoštvo endocervikalnih epitelnih stanica koje mogu sadržavati Chlamydia trachomatis kao intracelularni organizam koji zaražava te stanice.
Prvo treba sa štapićem očistiti cervikalni kanal (odstraniti cervikalnu sluz; izbjegavati vrijeme ovulacije za uzorkovanje).
Potom uzorkovati dakronskim štapićem ili citološkom četkicom rotirajući u cervikalnom kanalu bez doticaja površine rodnice.
b) uretralni uzorak: također treba sadržavati epitelne stanice. Dakronski štapić uvedemo 2 do 4 cm i potom rotiramo. Važno je ne mokriti minimalno, sat vremena prije uzimanja uzorka (preporučljivo 4 sata).
Druga metoda dijagnosticiranja klamidije je MOLEKULARNA METODA detekcije – DIGENE Hybrid Capture II
1. NAČELA TESTA
Test se bazira na detekciji specifičnog dijela genoma mikroorganizma. Osjetljivost testa je povećana amplifikacijom signala, koji nastaje kod prisustva mikroorganizama u uzorku.
Hibridizacija, koja je osnova testa, proces je stvaranja tzv. RNA:DNA hibrida; ispitivanom uzorku dodaje se RNA – proba specifična za traženi mikroorganizam. Ukoliko je u uzorku prisutan, dolazi do vezanja RNA – probe i specifičnog dijela ciljne DNA. Nastali kompleks je tzv. RNA:DNA hibrid koji se detektira pomoću kemiluminiscentnog supstrata i luminometra.
2. UZIMANJE UZORKA
a) cervikalni uzorci: trebaju sadržavati mnoštvo endocervikalnih epitelnih stanica koje mogu sadržavati Chlamydia trachomatis kao intracelularni organizam koji zaražava te stanice.
Prvo treba sa štapićem očistiti cervikalni kanal, a potom uzorkovati dakronskim štapićem ili citološkom četkicom rotirajući u cervikalnom kanalu bez doticaja površine rodnice.
b) uretralni uzorak: također treba sadržavati epitelne stanice. Dakronski štapić uvedemo 2 do 4 cm i potom rotiramo. Važno je ne mokriti prije uzimanja uzorka ( preporučljivo 4 sata ).
Set za uzimanje uzoraka ovom metodom se zove HYBRID CAPTURE (HC) CERVICAL SAMPLER.
2.Ureplasma urealyticum
Mycoplasma hominis
Mikoplazme su mikroorganizmi koji koloniziraju urogenitalni trakt i njihovim umnožavanjem se stvaraju uvjeti za razvoj bolesti.
Ureaplasma urealyticum
a) MUŠKARAC: Kod muškaraca uglavnom izaziva uretritis (Ureaplasma urealyticum je drugi po redu, uzročnik negonokoknog uretritisa).
Osim uretritisa, može izazvati prostatitis i epididimitis.
b) ŽENA: Kod trudnica može izazvati korioamnionitis, rupturu plodnih ovoja i poremećaj tijeka trudnoće.
Mycoplasma hominis
c) ŽENA: izaziva endometritis i salpingitis, a može biti povezana i s nespecifičnim vaginitisom.
d) Obje vrste mogu uzrokovati neonatalne infekcije (meningitis, septikemije, infekcije respiratornog trakta).
Obzirom da oba mikroorganizma mogu biti patogeni i bakterije koje koloniziraju urogenitalni trakt, kvantifikacija je neophodna kao pomoć u interpretaciji nalaza odraslih.
NAČELO TESTA
Metoda dijagnosticiranja koju koristimo je kultivacija u bujonu. Porast u kulturi detektira se promjenom boje indikatora, što je posljedica metabolizma mikroorganizama.
Test omogućuje identifikaciju (Ureaplasma urealyticum i Mycoplasma hominis) i titraciju tj. određivanje količine mikroorganizama u uzorku.
Test ujedno uključuje i ispitivanje osjetljivosti bakterijskog izolata na odgovarajuće antimikrobne lijekove.
UZIMANJE UZORKA
a) cervikalni uzorak: odnosi se na obrisak endocerviksa; uzorak mora sadržavati stanične elemente, jer su mikoplazme epicelularni mikroorganizmi, na površini stanice.
Najprije treba štapićem očistiti cervikalni kanal (odstraniti sluz i floru rodnice), a potom uzeti uzorak za analizu.
b) uretralni uzorak: također treba sadržavati epitelne stanice. Štapić uvedemo 2 do 4 cm i potom rotiramo. Važno je ne mokriti barem sat vremena prije uzimanja uzorka (preporučljivo 4 sata).
Ukoliko se istovremeno uzimaju uzorci za analizu „na mikoplazme“ i „na klamidiju“, tada treba najprije uzeti uzorak za mikoplazme, a potom za klamidiju.
Uzorak za mikoplazme se odmah nakon uzimanja inokulira u tekući transportni medij (bočica sa zelenim čepom) koji se čuva u hladnjaku do 72 h (+4ºC) ili do 6 mj. u zamrzivaču (-20ºC ).
3.Humani papillomavirus (HPV)
Metoda dijagnosticiranja je MOLEKULARNA METODA detekcije –
DIGENE Hybrid Capture II.
1. NAČELA TESTA
Test se bazira na detekciji specifičnog dijela genoma mikroorganizma.
Osjetljivost testa je povećana amplifikacijom signala, koji nastaje kod prisustva mikroorganizama u uzorku.
Hibridizacija, koja je osnova testa, proces je stvaranja tzv. RNA:DNA hibrida; ispitivanom uzorku dodaje se RNA – proba specifična za traženi mikroorganizam. Ukoliko je u uzorku prisutan, dolazi do vezanja RNA – probe i specifičnog dijela ciljne DNA. Nastali kompleks je tzv. RNA:DNA hibrid koji se detektira pomoću kemiluminiscentnog supstrata i luminometra.
Ovom metodom možemo detektirati i diferencirati HPV tipove niskog rizika ( 6/11/42/43/44) i HPV tipove visokog rizika ( 16/18/31/33/35/39/45/51/52/56/58/59/68).
2. UZIMANJE UZORKA
a) cervikalni uzorci: trebaju sadržavati mnoštvo endocervikalnih epitelnih stanica koje mogu sadržavati HPV kao intacelularni organizam koji zaražava te stanice.
Prvo treba sa štapićem očistiti cervikalni kanal, a potom uzorkovati dakronskim štapićem ili citološkom četkicom rotirajući u cervikalnom kanalu bez doticaja površine rodnice.
b) uretralni uzorak: također treba sadržavati epitelne stanice. Dakronski štapić uvedemo 2 do 4 cm i potom rotiramo. Važno je ne mokriti prije uzimanja uzorka (preporučljivo 4 sata).
Set za uzimanje uzoraka ovom metodom se zove HYBRID CAPTURE (HC) CERVICAL SAMPLER.
Uzimanje uzorka
a) cervikalni uzorci: trebaju sadržavati mnoštvo endocervikalnih epitelnih stanica koje mogu sadržavati HPV kao intacelularni organizam koji zaražava te stanice.
Prvo treba sa štapićem očistiti cervikalni kanal, a potom uzorkovati dakronskim štapićem ili citološkom četkicom rotirajući u cervikalnom kanalu bez doticaja površine rodnice.
b) uretralni uzorak: također treba sadržavati epitelne stanice. Dakronski štapić uvedemo 2 do 4 cm i potom rotiramo. Važno je ne mokriti prije uzimanja uzorka (preporučljivo 4 sata).
Set za uzimanje uzoraka ovom metodom se zove HYBRID CAPTURE (HC) CERVICAL SAMPLER.
Napomena:
Uzorak za Papa test uzeti prije uzimanja uzorka za DNA testiranje.
Ako se provodi kolposkopija, uzorak za DNA testiranje uzeti prije nanošenja octene kiseline ili jodnih pripravaka na vrat maternice.
1. Odstraniti višak mukoze s osi cerviksa i oko ektocerviksa pomoću vate ili dakrona.
2. Uvesti četkicu 1-1,5 cm u os cerviksa tako da zadnji kraj četkice dodiruje ektocerviks ( slika A )
Slika A
Okrenuti 3 puna kruga u smjeru suprotno od smjera kazaljke na satu.
ČETKICU NE UVODITI POTPUNO U CERVIKALNI KANAL!
3. Četkicu izvaditi iz cervikalnog kanala. Izbjegavati dodir četkice s okolinom do stavljanja u spremnik za transport.
4. Četkicu s brisom staviti do dna u spremnik s transportnim medijem. Štapić prekinuti ( slika B ) i dobro zatvoriti čepom ( slika C )
Slika B
Slika C
Upute za skladištenje
Čuvati spremnike s uzorcima na temperaturi od 15-30 0C. Ne upotrebljavati nakon isteka roka valjanosti.
Prijenos uzoraka
Spremnici s uzorcima mogu se čuvati 2 tjedna na sobnoj temperaturi i poslati u laboratorij bez hladnjaka. Nakon prijema u laboratorij moguće je čuvati uzorke na temperaturi 2 – 8 0C najviše 1 tjedan do izvođenja testa. Ako se testiranje ne izvodi unutar 1 tjedna, uzorci se mogu čuvati na temperaturi -20 0C do 3 mjeseca prije izvođenja testa.